El primer virrey se casó con Catalina de Vargas y Carvajal, hija del Contador Mayor de los Reyes Católicos. Tuvo con ella tres hijos: Íñigo, Francisca y Francisco de Mendoza. En 1526, don Antonio contaba con 35 años y sus logros personales no habían sido muy notables. Pero ya viudo, el 10 de marzo de 1526 decidió casarse con la Infanta doña Isabel de Portugal y hacer un viaje por Andalucía para conocer sus tierras sureñas, adonde llegaban las mercancías del llamado Nuevo Mundo. Como fuera muy bien recibido por Luís Hurtado de Mendoza, hermano de Antonio, y en ese momento Capitán General de Granada, todos los hermanos recibieron mercedes, y Antonio fue nombrado embajador en Hungría. Fue el inicio de sus misiones diplomáticas. Estuvo en Flandes, Inglaterra, Italia y Alemania. Además, en 1528 fue nombrado gobernador de la Provincia de León dentro de la Orden de Santiago, a fin de apaciguar a los moriscos de Badajoz.
Debido a su gran experiencia como embajador, militar y político, a más de haber tenido contacto con los levantados moriscos tan difíciles de controlar, más el hecho de haber fungido como camarero real en 1530, se le consideró idóneo para ocupar el cargo de virrey en las Américas. Así pues, se le nombró virrey, Capitán General de Nueva España y presidente de la Real Audiencia de México, el 17 de abril de 1535. En seguida empezaron las dificultades con Hernán Cortés, pero al final el conquistador hubo de someterse a Mendoza. Una vez tomado el mando, el 14 de noviembre convocó al gobernador de Nueva Galicia, Nuño Beltrán de Guzmán -a quien don Vicente Riva Palacio llamara El aborrecible gobernador del Pánuco y quizá el hombre más perverso de cuantos habían pisado la Nueva España-, a un juicio de residencia en el que se revisaban los actos que hubiere efectuado durante sus funciones y los cargos que se hubiesen hecho en su contra; ya que se le acusaba de ser corrupto y de someter a terribles maltratos a los indígenas. Tal juicio le valió la cárcel al tal Nuño. Asimismo, Antonio de Mendoza desbarató una rebelión de esclavos negros en septiembre de 1537, y cuatro años después participó en una rebelión de indios caxcanes y chichimecas en Nueva Galicia. Batalla que se denominó la Guerra de Miztón. Los indios fueron derrotados en febrero de 1542.
El mandato del primer virrey tuvo una duración de quince años, y sus leyes administrativas lo convirtieron en el organizador de la Nueva España. Hizo varias cosas importantes: En 1535 fundó la Casa de Moneda, en donde se acuñaron las macuquinas, que eran monedas de plata y cobre a la manera española. Dio inicio a la primera imprenta de América, que tuvo como impresor al famoso Juan Pablos, y en donde se publicaría la Breve y compendiosa Doctrina Christiana en lengua mexicana y castellana, que escribiera el obispo Juan de Zumárraga. Apoyó a Cortés en sus viajes de conquista, que le llevaron a descubrir la península de Baja California. En 1539, patrocinó a fray Marcos de Niza para que viajara para encontrar las ciudades de Cíbola y Quiviria, que se suponía se encontraban en algún lugar al norte de la Nueva España, las cuales obviamente nunca encontró, por tratarse de ciudades míticas plenas de riqueza, según afirmaba la leyenda inspirada en las ambiciones españolas. Firmó una capitulación con Pedro de Alvarado que en ese momento era gobernador de Guatemala, a fin de explotar la llamada Tierra de la Especería, misión que continuaría Juan Rodríguez Cabrillo una vez acaecida la muerte de Alvarado. A más de ello fundó el Colegio Imperial de Santa Cruz de Tlatelolco, destinado a la educación de los indios de la nobleza; colegio en donde impartían clase Andrés de Olmos y fray Bernardino de Sahagún. También creó el Colegio de San Juan de Letrán, destinado a indios y mestizos, y el Colegio de la Concepción al que acudían sólo mujeres.
Dedicó parte de su tiempo a dictar ordenanzas en donde se ordenaba que los indios fueran bien tratados. Abrió las minas de plata de Zacatecas; remodeló el Puerto de Veracruz; y en 1541, fundó la Ciudad de Valladolid, en lo que fuera el valle de Guayangareo en Michoacán.
Debido a su activa participación en el derrocamiento de las Nuevas Leyes que no aceptaban los conquistadores y los encomenderos, en 1546, el visitador Francisco Tello de Sandoval lo acusó de cuarenta y seis cargos en su contra, y fray Bartolomé de las Casas lo excomulgo por defender a los encomenderos. Dada su experiencia en México para sofocar rebeliones y administrar el virreinato, el 8 de julio de 1549 fue nombrado Virrey, Gobernador, Capitán General y Presidente de la Real Audiencia de Lima, Perú. Pero, no dudaría mucho en este lugar, pues achacoso, enfermo y con secuelas de una hemiplejia, duró tan sólo diez meses en el cargo. Murió el 21 de julio de 1552, en Lima, Virreinato del Perú.