La Inquisición española contaba con tres tribunales en las tierras americanas conquistadas. Uno se encontraba en Lima, Perú, otro en Cartagena de Indias, Colombia, y el tercero en México, fundado en 1579. La tarea principal de la Inquisición consistía en proteger la religión católica, la fe, y las normas de conducta de la Nueva España. Aun cuando todavía no se instituía oficialmente en México, el primer ajusticiado por la Inquisición en tierras novohispanas se llamó Marcos de Alcoahuacan, quien fuera juzgado por los religiosos que acompañaban a Hernán Cortés por el cargo de concubinato (para algunos por bigamia), de acuerdo a la bula Alias Felicis, emitida en 1521, que permitía a los frailes ejercer funciones de obispo en caso de necesidad. No fue sino hasta el año de 1524, cuando Martín de Valencia adquirió poderes episcopales en México, otorgados gracias a la bula papal denominada Exponi Nobis de fecha 1522.
Marcos de Alcoahuacan fue, por tanto, el primer indígena víctima de la Inquisición. Otro indígena importante juzgado por la Santa Inquisición fue Carlos Chichimecatecuhtli Ometochtzin, noble acolhuacano y gobernante de Texcoco quien fuera nieto de Netzahualcóyotl, el rey poeta, e hijo de Nezahualpilli. Este noble señor fue acusado de promover rebeliones en contra de la tiranía española y de seguir, a escondidas, con sus creencias religiosas y con la adoración a sus dioses, a más de ser acusado de practicar sacrificios humanos. Debido a estos cargos fue apresado por los familiares de la Inquisición, llevado a la capital de la Nueva España y juzgado por fray Juan de Zumárraga, primer obispo de la Diócesis de México, e inquisidor apostólico de 1536 a 1543, quien tuvo en su haber ciento treinta y tres casos de herejía.
El primero de los cargos a don Carlos fue el de idolatría, para luego ser acusado de herejía, como queda dicho, acusado por sus propios hermanos indios. Después del juicio, se le condenó a morir en la hoguera un día de noviembre del año 1539 y le fueron incautados todas sus posesiones. Anteriormente, don Carlos había sido llevado de su Texcoco a Coyoacan, donde un grupo de frailes se dio a la tarea de convertirlo al catolicismo, previo bautizo y de haberle nombrado Carlos en honor del rey de España Carlos V de Alemania y I de España. Parece ser que Chichimecatecuhtli aprendió muy bien la doctrina cristiana, y una vez terminados sus estudios se le ordenó que gobernase el Señorío de Texcoco, el más extenso de la Triple Alianza. Sin embargo, las enseñanzas de los frailes no arraigaron, pues una anécdota nos cuenta que en una ocasión en que fue de visita a Chiconautla, donde vivía su hermana casada con el cacique de tal población, al escuchar a unos pillis, hijos de nobles, cantar el himno Adiós, Reina del Cielo, Madre del Salvador, montó en cólera y mandó que su hermana callase a los jóvenes y los llevara al Calpulli para hablar con ellos. Cuando llegaron, el cacique de Texcoco los amonestó y se mal expresó de los españoles y de sus ideas tan ajenas a los verdaderos valores de la religión indígena, y ensalzó la religión y la filosofía propias de los pueblos nahuas. Uno de los pilli, completamente fanatizado por los frailes, Francisco Maldonado, su sobrino, acudió a la Ciudad de México, pidió ver a Zumárraga y acusó a don Carlos. El escritor Luis González Obregón recrea las palabras que le costaron la vida al Cacique de Texcoco:
¿Quiénes son estos que nos deshacen, e perturban, e viven sobre nosotros, e los tenemos a cuesta y nos sojuzgan? Pues aquí estoy yo, e allí está el señor de México Yoanize, y ahí está mi sobrino Tezapille, señor de Tacuba, y ahí está Tlacahuepantli, señor de Tula, que todos somos iguales y conformes, y no se ha de igualar nadie con nosotros; que está es nuestra tierra, y nuestra hacienda y nuestras alhajas, y nuestra posesión, y el señorío es nuestro, y a nos pertenece, y a quien viene aquí a sojuzgarnos, que no son nuestros parientes ni nuestra sangre y se nos igualan, pues aquí estamos, y no ha de haber quien haga burla de nosotros.
El juicio de Chichimecatecuhtli se encuentra en el Archivo General de la Nación. En 1910, como parte de los festejos del Centenario de la Guerra de Independencia, Porfirio Díaz mandó que se publicase.
Aparte del caso de Carlos Chichimecatecuhtli, hubo otros más de indígenas importantes como lo fueron los sacerdotes Martín Océlotl, de Texcoco, Andrés Mixcóatl y Cristóbal Papálotl. El primero de ellos recibió como castigo azotes, la confiscación de sus bienes, y el destierro a España para ser juzgado nuevamente, lo cual constituía una arbitrariedad. A don Miguel Puchtecatlatlotla, de México, se le acusó de idolatría y herejía y de ocultar, junto con don Baltasar, cacique de Texcoco, los tesoros del Templo Mayor, que a decir de los españoles existían sin lugar a dudas.